Bonjour à toutes et tous,
Nous avons inclu en paraffine des genoux de rat avec le même programme d'imprégnation de genoux de souris que nous utilisons classiquement. Les genous ont bien été décalcifiés. Toutefois, à la coupe, on observe un espace sans paraffine entre les 2 articulations (fémur et tibia). On voit une démarcation entre le genou et la paraffine environnante. Je soupçonne que notre imprégnation en paraffine n'a pas été suffisante. Quelqu'un travaille-t-il en routine sur ce type d'articulation de rat et pourrait me conseiller sur les temps d'incubation des différents solvants et paraffine? Voici le procole sur notre ASP300 de Leica:
ETOH 70° - 2 x 30min
ETOH 96° - 2 x 1h
ETOH 100° - 1h + 1h30 + 2h
Xylène - 45min + 1h + 1h15
Paraffine - 45min + 1h15 + 2h
Merci pour votre aide et conseils,
Bonne soirée,
Nelly Pirot
Bonjour Nelly, en effet tes coupes sont très belles. En effet ton manque de coloration apparaît dans le cartilage calcifié mais ce n'est pas homogène et l'hypothèse de la décalcification est à suivre. Pour la décalcification nous utilisons l'immunocal (StatLab) qui est en effet à base d'acide formique 5%. Décalcification pendant 5-7 jours avec test chimique à la fin pour vérifier la complétude de la décalcification. Nous coupons également à 5 um. As-tu vérifié que ta lame de microtome est bien stable et n'oscille pas pendant la coupe ?
Bonne chance pour la suite. Et merci pour ton retour positif :)
Nathalie
Merci Nathalie et Christian pour vos retours respectifs. On a tenté ce protocole et çà a très bien fonctionné. On a encore juste un problème : la tinctorialité du cartilage en safranin O fast green n'est pas aussi bonne que sur les genoux de souris. Les genoux de rat ont été décalcifiés en TBD-2 15 jours à TA en changeant la solution tous les 2 jours. On suppose avoir trop décalcifié ce qui induit une perte de la coloration des protéglycans du cartilage articulaire du fémur (cf illustration ci-dessous). On coupe à 3µm et ne suis pas certaine que si on augmente l'épaisseur on arrivera à restaurer cette perte de marquage. On prévoit de faire une cinétique de décalcification pour améliorer la tinctorialité. Mais je me demandais ce que vous utilisiez comme méthode de décalcification? Avez vous des conseils à nous donner? J'ai vu dans des articles l'acide formique 5%, je me disais qu'on allait peut être testé cela. Merci et bonne journée,
Nelly
Bonjour Nelly, pour compléter le protocole envoyé par Christian, nous coupons nos genoux en deux que ce soit dans le sens coronal ou sagittal. Perso je préfère le sens sagittal qui te donne accès à tous les tissus du genou incluant la membrane synoviale. En effet pour le sens coronal de coupe, mes collègues retirent la rotule ainsi que le Hoffa's fat pad qui est un tissu important.
Dans les deux cas il n'y a pas de problème d'imprégnation.
Bonne chance
Nathalie
Bonjour, voici notre protocol:
Les etapes de paraffine sont sous pression/vide.
Bonne journee
Christian