j'ai fixé par perfusion intracardiaque (PFA4%) des cerveaux de PNH traités ensuite pour être coupés ultérieurement grâce un microtome à congélation : après une post-fixation PFA4%, passage dans des bains de saccharose puis stockage à -20°C dans un milieu cryoprotecteur. (éthylène glycol+glycérol dans Tris)
Je souhaiterais pouvoir inclure ces cerveaux en paraffine.
Existe-t-il un ou des protocoles que je pourrais suivre pour les rincer, puis les déshydrater?
Peut-on espérer avoir des marquages en histo classique et en immunohistofluo après ces traitements?
merci de votre aide
Bonjour Caroline, j'ai déjà fait un transfert de l'OCT à la paraffine sans souci, il faut bien laver, ici dans le Tris buffer puis faire une déshydratation et inclusion en paraffine classique. Je ne me souviens plus si j'avais fait une IHC après mais la HE te dira déjà si les tissus sont OK.
Bonne chance pour tes tests
Nathalie
Merci beaucoup Brigitte pour toutes ces informations. Il est certainement préférable de travailler avec des petites pièces de tissus pour pouvoir bien rincer. Je comprends la nécessité de l'azide de sodium si le rinçage est fait à 37°C;
Bien à vous
Caroline
bonjour Caroline
je n ai pas de protocole spécifique à proposer, mais pour avoir testé un protocole proche, je dirai que le PEG et le glycérol étant solubles dans l eau de même que le saccharose je laverai extensivement l'échantillon dans du tampon, soit un we complet, dans un très grand volume 50ml ml pour 0,5cm3 d’échantillon sur une roue a 37°C. Important: N'oubliez pas de mettre 0,02% d azide de sodium NaN3 (antibactérien) ou autre dans le tampon. il faut juste très très bien laver car la viscosité de ces milieux PEG glycérol inhibe la pénétration des anticorps si vous voulez faire de IF ensuite. le risque serait plutôt d avoir une alteration de la morphologie à la décongélation.
Cordialement
brigitte Delhomme SPPIN CNRS UMR8003