La microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) est une technique basée sur l'histologie qui permet aux chercheurs d'obtenir des piles alignées en série 2D d'images à haute résolution pour effectuer des reconstructions 3D. La visualisation tridimensionnelle permet une appréciation de la topologie et de la morphologie des structures ainsi qu'une quantification volumétrique précise et une comparaison des échantillons qui est impossible avec l' histologie. L'originalité de la technologie est de produire des images directement à partir de la face du bloc, plutôt qu'à partir des coupes. Le contraste des images obtenues en nuances de gris repose sur l'utilisation des propriétés fluorescentes de l'éosine et de l'acridine orange, et forme un contraste très proche d'une coloration hématoxyline-éosine en histologie. L'information est capturée sous la forme d'images sériées parfaitement alignées.
Nous avons développé un nouveau prototype HREM appelé "Histo3D" consistant en l'assemblage d'un microtome rotatif Leica Biosystems Nanocut avec une optique et une caméra. Les données brutes 2D ont été importées dans le logiciel Avizo pour la visualisation volumétrique, la segmentation et l'analyse quantitative.
Les échantillons sont déshydratés dans des concentrations croissantes d'éthanol puis incubés dans un mélange 100 % Ethanol /résine (JB4) contenant les colorants fluorescents acridine orange et éosine puis résine pure et enfin inclus dans la résine contenant l'activateur. Les temps d'incubation dans la résine varient en fonction de la taille des échantillons. L'épaisseur de coupes est choisie de manière à obtenir des voxels cubiques (isotropiques) en fonction du zoom utilisé.
Nous présentons ici quelques exemples d'application sur différents échantillons biologiques. Des segmentations et les reconstructions 3D de nerfs crâniens et périphériques normaux de E11.5 à E15.5 ont été réalisées sur des embryons de souris. Nous proposons également une méthodologie pour quantifier le volume des plaques d'athérosclérose de souris adultes mutantes ApoE. Des données 2D et 3D d'échantillons d'yeux de rats, de larve de drosophile et de zebrafish sont présentés. La technique a également donné des résultats intéressants sur des échantillons de lin.
Nous montrons que le système Histo3D répond parfaitement aux besoins d'une utilisation en tant que technique HREM classique. Les reconstructions 3D de structures permettent d'abord de mettre en évidence des formes et des structures microanatomiques qui ne peuvent pas être décrites par dissection, avec des techniques 2D classiques ou avec des techniques d'imagerie 3D à plus faible résolution. Ces reconstructions permettent également de faire des analyses quantitatives très précises.