La teneur et la répartition des tissus adipeux chez la truite a un impact direct sur la qualité des carcasses (rendements de découpe/transformation) et de la chair (qualités nutritionnelles et sensorielles). La caractérisation des tissus adipeux, comme par exemple l'analyse de la cellularité des adipocytes, passe généralement par l'isolement des adipocytes (analyse ex situ ou in vitro). Les adipocytes sont plus rarement étudiés dans leur contexte tissulaire. L'histologie de ce tissu est rendue difficile par la solubilisation des lipides dans les solvants organiques lors de l'inclusion en paraffine et la difficulté à réaliser des coupes au cryostat sur ces tissus très riches en lipide. Des oxydants forts comme le tétroxyde d'osmium permettent d'insolubiliser les lipides mais nos essais préliminaires ont montré que les tissus adipeux n'étaient fixés qu'en surface rendant impossibles les coupes histologiques. Notre objectif est donc de mettre au point une méthode de marquage des adipocytes (lipides) et des structures protéiques et d'imager en 3D ces tissus afin de mieux caractériser les différents tissus adipeux de truite.
Les tissus adipeux périviscéraux et sous cutanés sont prélevés puis coupés en bloc plan à l'aide d'un couteau double lames. Les échantillons sont ensuite fixés au PAF 40/0 à 4 0 C pendant une nuit puis rincés en PBS et stockés en PBS azide PAF 0.5% à 40 C. Les échantillons sont rincés en PBS puis marqués pendant 8h avec le 5-DTAF (marqueur des protéines) à 200ug/ml puis rincés en PBS 4 fois et ensuite marqués au Nile Red (marqueur lipidique) au 1/500 toute la nuit. Les échantillons sont ensuite transparisés dans une solution à 50 0/0 d'histodenz pendant3h puis à 1 00 % pendant 2.5 jours (indice de réfraction 1 .4571). La solution d'histodenz est changée 2 fois avant observation. L'imagerie 3D est réalisée à l'aide du microscope confocal à balayage laser SP8 de chez Leica et avec l'objectif à immersion HC Fluotar L IMM MotCORR VISIR (ne-1,457). Nos échantillons sont imagés sur une profondeur de 300um et sur une mosaïque 2x3 images. Les images en 3D ainsi obtenues sont analysées avec des algorithmes de segmentation basés sur de l'intelligence artificielle (Cellpose) ce qui nous permet de mesurer le volume de chaque adipocyte.
Nous avons ainsi pu mettre au point une méthode de marquage, visualisation et quantification des adipocytes in situ, préalable à des études de la physiologie de ces cellules en termes de dynamique cellulaire (hyperplasie, hypertrophie).