L'ingénierie tissulaire est actuellement en plein développement notamment avec la mise en place des techniques de bioimpression de tissus vivants en 31). Ces technologies permettent d'obtenir des structures d'architecture 3D complexes, de tailles variables allant de quelques millimètres à plusieurs centimètres cubes et pouvant contenir plusieurs types cellulaires. Ces modèles occupent une grande place dans le domaine de la médecine régénérative, puisqu'il est possible de recréer des tissus tels que de la peau, de l'os, du cartilage ou encore des réseaux vasculaires. La plateforme 3d.FAB participe au développement de ces modèles in-vitro bioimprimés en 3D.
L'une des méthodes permettant de caractériser, d'optimiser et de valider ces modèles est l'histologie. Cependant, avant de savoir si les cellules sont réparties uniformémentau sein de l'objet, si elles se sont organisées en microstructures, si elle se sont différenciées ou si elles ont produit de la matrice extracellulaire, plusieurs paramètres sont à prendre en compte et des optimisations sont nécessaires.
Les objets 3D cellularisés sont biofabriqués à partir d'un hydrogel à base de matériaux biocompatibles : de la gélatine, de l'alginate et du fibrinogène auxquels sont ajoutées des cellules primaires de différents tissus. Ils sont bioimprimés par microextrusion grâce à un bras robotique ou imprimante 3D (BioAssembly Bot@), sont ensuite consolidés selon différentes méthodes de réticulation et finalement mis en culture. Suite à une période de maturation et de développement du tissu allant de 7 à 50 jours, ceux-ci sont fixés afin d'être coupés, puis analysés.
Les protocoles de déshydratation standards, pour tissus natifs, ont été ajustés à ces biomatériaux. Les protocoles de coloration histologique et immunohistologique ont également dû être optimisés pour nos hydrogels en faisant varier les temps de coloration, les méthodes de démasquage, les solutions de blocage et les dilutions d'anticorps.
Nous avons pu mettre au point des protocoles ajustés permettant de prendre en charge des tissus bioimprimés de tailles variables (0,2 à 150 cm3). Nous avons ainsi observé qu'à la fois les conditions de réticulation et la taille de l'objet impactent la qualité de la déshydratation. Il est donc indispensable de définir au préalable le protocole de déshydratation adapté aux caractéristiques de l'objet. Nous avons également mis en évidence que le protocole de préparation des tissus bioimprimés, en amont de la déshydratation, semble avoir un fort impact sur la qualité des colorations histologiques. Par exemple, la présence résiduelle de milieu de culture au sein des hydrogels impacte les analyses, générant un marquage hétérogène des coupes.
En étudiant et en optimisant les différentes étapes de l'analyse histologique, nous avons pu mettre au point au sein de 3d.FAB un panel de protocoles dédiés aux tissus bioimprimés : préparation des échantillons, déshydratation, histologie (HE, trichrome de Masson) et immunohistologie (Coll, Colll, ISMA, Caspase3, MUC1, fibronectine et PHEX).