Imagerie multiplex Cell Dive® pour visualiser les niches de cellules souches/progénitrices du cancer du foie
Roselyne VIEL1, Romain DESERT3, Natalia NIETO3, David POINTU4, Nicolas MOUCHET1, Anthony SEBILLOT1, Alain FAUTREL1, Orlando MUSSO2
1 Univ Rennes, CNRS, INSERM, UMS Biosit, Core Facility H2P2, 35000 Rennes, France;
2 INSERM, Univ Rennes, UMR 1317, Nutrition, Métabolismes et Cancer (NuMeCan), 2 Rue Henri le Guilloux, 35000 Rennes, France;
3 Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 840 S. Wood Ave, Suite 130 CSN, Chicago, IL 60612, USA.;
4 Leica Microsystems GmbH, Ernst-Leitz-Straße 17–37, 35578 Wetzlar, Germany
Contexte et objectifs : Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la deuxième cause de mortalité attribuée au cancer chez l'homme. Les CHCs apparaissent dans la plupart des cas chez des patients souffrant de maladies hépatiques fibroinflammatoires chroniques, résultant d'un abus d'alcool, d'une hépatite chronique, d'une stéatose hépatique non alcoolique et, moins fréquemment, de mutations génétiques. Les maladies fibro-inflammatoires chroniques du foie entraînent un dépôt excessif de complexes protéiques de la matrice extracellulaire (MEC) qui modifient complètement l'architecture du foie, altèrent sa fonction et conduisent à l'émergence de CHCs. Ces complexes protéiques de la MEC sont composés de collagènes, de glycoprotéines non collagéniques, de protéoglycanes, de facteurs de croissance se liant à la MEC et de polypeptides régulateurs dérivés. Ainsi, la MEC est à la fois un échafaudage structurel et une plateforme de signalisation régulant les fonctions cellulaires. L'identification de la niche des cellules cancéreuses souches/progénitrices est importante car ces cellules ont tendance à résister aux traitements anticancéreux. Bien que les CHCs soient des tumeurs molles et cellulaires, certaines d'entre elles abritent des structures intra-tumorales focales composées de dépôts d'ECM qui entourent les cellules cancéreuses souches/progénitrices. Ces structures sont donc appelées des "nids fibreux". Leur composition moléculaire a été identifiée par protéomique quantitative. Une signature minimale de 11 protéines a été associée à un mauvais pronostic vital des patients, par analyse multivariée de Cox, et validée par immunohistochimie
multiplex.
Méthodes : Des cryo-coupes (7 µm) de tissu de CHCs frais congelé dans l’isopentane refroidi en azote liquide, puis stocké à -80°C pendant plus de 10 ans ont été fixées pendant 10 minutes dans du formol à 4 % pH 7,4, à température ambiante, rincées dans du PBS et perméabilisées dans du Triton-X-100 à 0,1 %. Le traitement ultérieur a été effectué conformément aux instructions de Cell Dive (Leica Microsystems) : blocage, coloration des noyaux au DAPI, imagerie du tissu entier, contrôle de la qualité et correction de l’auto-fluorescence. Les lames ont été placées dans la cellule ClickWell, où elles ont été lavées avec un tampon Tween et marquées avec les anticorps appropriés, puis imagées. Quatre séries de quatre anticorps ont été appliquées au même bloc de tissu monté en entier, de sorte que les lames restent dans le ClickWell pendant toute la durée du processus.
Résultats : Nous avons co-détecté, sur la même coupe, 10 protéines de la MEC et 3 protéines dites « repères topographiques » dans des nids de fibrose de haut grade de 3 CHCs humains. Les images ont été visualisées avec le logiciel d'imagerie HALO (Indica Labs) et colorées artificiellement à l'aide d'une palette RVB adaptée aux daltoniens.
Conclusion : L'intégration de l'analyse protéomique et de l'immunodétection multiplex a permis de définir l'importance clinique des nids de fibrose du CHC. Cette avancée souligne le potentiel de l'immunodétection multiplex pour aider les pathologistes et les chercheurs à localiser avec précision des combinaisons complexes de molécules biologiquement pertinentes dans des compartiments tissulaires distincts et des populations cellulaires spécifiques, ce qui nous permet de mieux comprendre les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire.