La complexité des candidats médicaments testés lors d’un essai clinique requière de plus en plus des évaluations approfondies de biomarqueurs. Le but de ce projet est de développer et valider un panel multiplex en immunofluorescence avec les marqueurs CD3, CD4, CD8, FoxP3, CD20 et Ki67 pour une application à des échantillons d'essais cliniques. La méthode a été développé en utilisant la technologie « Tyramide Signal amplification (TSA) » sur la plateforme d’immunohistochimie Leica Bond RX et testé sur des échantillons de tissus de cancer bronchique non à petites cellules (CPNPC). La validation a inclus une évaluation de la spécificité, de la sensibilité et de la reproductibilité de l’essai. Les images ont été numérisées avec le PhenoImager HT 2.0. Une analyse d'image numérique approfondie a été réalisée avec le module HighPlex FL du logiciel Halo. Pour confirmer la fiabilité de l’essai, le MFI (intensité moyenne de fluorescence) a été mesuré en triplicate pour chaque chaîne de biomarquer et a montré un % de Coefficient de Variation (CV) inférieur à 20, démontrant la cohérence des expériences. Pour cette analyse, un algorithme a été développé pour la détection nucléaire et de l'immunophénotypage des marqueurs simples et coexprimés tels que : CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD4+FoxP3+. La précision du classificateur, la sensibilité du seuil de signal et la détection du type de cellule et la détection des noyaux (>75%) ont été attentivement évaluées lors du développement de l'algorithme. En conclusion, nous avons développé et validé un panel multiplex immunofluorescence à 6 biomarqueurs pour l'analyse des échantillons cliniques avec succès.