La transparisation optique d’échantillon est une technique qui rend les tissus transparents, permettant une visualisation détaillée des structures en trois dimensions. Une des approches possible repose sur la méthode CUBIC, constituée de deux étapes : l’élimination d’une partie des lipides par la solution de CUBIC-L et sur la correction des indices de réfraction par la solution de CUBIC-R afin de réduire la diffusion de la lumière dans le tissu.
Le traitement CUBIC-L pouvant altérer les épitopes reconnus par les anticorps primaires, différents immunomarquages ont été réalisés sur coupes congelées d’explants cutanés ayant subi un traitement CUBIC-L. Cette démarche a permis de sélectionner les anticorps compatibles pour le marquage sur explants entiers après transparisation.
Le CUBIC-R pouvant altérer la stabilité des fluorochromes, nous avons testé différents Alexa Fluor dans des solutions de CUBIC-R. Cette approche a permis d’identifier les conditions optimales de conservation du signal fluorescent et de sélectionner le fluorochrome le plus adapté.
La mélanine contenue dans la peau est associée à une atténuation du signal en imagerie 3D, rendant nécessaire une étape de dépigmentation. Nous avons montré que le traitement au peroxyde d’hydrogène n’impacte ni la qualité de l’immunomarquage ni l’autofluorescence dans des explants cutanés entiers.
La principale difficulté de l’imagerie 3D de la peau clarifiée ne réside pas dans la transparisation elle-même, mais dans l’optimisation de l’immunomarquage, comprenant le choix des anticorps primaires, la dépigmentation et la stabilité des fluorophores. Nos résultats démontrent qu’une optimisation adaptée permet d’obtenir une imagerie 3D cutanée par microscopie light-sheet.