Les techniques de microdissection laser ont pour but d'isoler des cellules ou des groupes de cellules grâce à un contrôle morphologique effectué sous un microscope, afin d'effectuer des études à l’échelle moléculaire. Ces techniques, qui évoluent constamment, offrent une approche utile dans plusieurs domaines d’application (animale et végétale) et nécessitent un savoir-faire particulier. Ces applications et évolutions technologiques sont au cœur de l’activité du réseau Microlaser Biotech, une branche de l’Association Française d’Histotechnologie (AFH), qui rassemble un groupe d’histologistes et de biologistes moléculaires auquel les auteurs du présent article appartiennent.
Les auteurs présentent ici l’histoire souvent méconnue de la mise en place de ces techniques de microdissection, qui n’ont pas toujours été associées au laser. Ils reviennent sur le principe de cette approche pouvant être exécutée sur une variété d'échantillons tissulaires, donnent des exemples d’applications dans des domaines variés tels que l’oncologie, la neurologie ou encore la biologie végétale.
Les étapes clés, de la préparation des échantillons à la microdissection en passant par les colorations sont décrites en détail. Les différents dispositifs commerciaux disponibles aujourd’hui sont présentés, en évoquant les évolutions futures. En effet cette méthode utile pour étudier l'ADN (Acide désoxyribonucléique) ou l'ARN (Acide ribonucléique) contenu dans des cellules cibles est amenée à connaître de nouveaux développements, comme par exemple, le couplage avec une analyse protéomique dans le but d'identifier certaines protéines spécifiques

Dans cet article nous proposons de revisiter l’émergence d’une technique d’imagerie innovante : l’histologie Raman stimulée (SRH). Dans un premier temps nous rappellerons le principe de la spectroscopie Raman et les limites de cette technologie avant d’introduire les bases de l’optique non-linéaire. Nous présenterons alors les avantages intrinsèques relatifs aux techniques d’imagerie non-linéaires, notamment celles issues du Raman cohérent, qui permettent d’obtenir des images multimodales renseignant sur la morphologie des tissus et leur composition chimique. Nous expliquerons comment il est alors possible d’obtenir, sans aucun marquage, des images histologiques virtuelles en utilisant des images de microscopie par diffusion Raman stimulée (SRS) et de génération de la seconde harmonique (SHG). Nous retracerons les évolutions technologiques qui ont permis à ce domaine d’évoluer rapidement et nous décrirons les éléments nécessaires à l’implémentation de telles techniques d’imagerie, non invasives et sans marquage. Nous relaterons les premières études du domaine d’abord appliquées aux tumeurs du système nerveux centrale puis dans le domaine gastrique. Nous suivrons une démarche pas à pas pour démontrer le potentiel de cette technique d’imagerie novatrice qui présente des qualités nécessaires pour devenir un outil de choix dans les services hospitaliers notamment de chirurgie et d’histopathologie.

Les cultures cellulaires 2D in vitro classiques ont montré leurs limites, aussi, le développement de cultures cellulaires "organotypiques" de tissus épithéliaux trouvent toute leur place pour se substituer aux biopsies animales. Les organoïdes sont des cultures cellulaires organotypiques 3D dérivant de cellules souches de tissus animaux. Des mises au point de protocoles d’obtention d’organoïdes issus de différents organes sont en cours à INRAE (Jouy-en-Josas). Leur caractérisation est une étape importante pour vérifier la différenciation des cellules.
Dans l’unité de Génétique Animale et de Biologie Intégrative (INRAE UMR1313 GABI), l’équipe de Génétique, Microbiote, Santé (GeMS) a mis au point la production d’organoïdes intestinaux de porc. La plateforme @BRIDGe (Animal Biological Resources for Integrated and Digital Genomics) de l’unité GABI apporte son expertise en histologie et biologie moléculaire pour la caractérisation des organoïdes obtenus par ces protocoles de production.

Les organoïdes sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) qui reproduisent in vitro la micro-anatomie et au moins une fonction d’organe. Ce modèle d’organe est obtenu à partir d’une ou plusieurs cellules souches qui dans nos études sont des cellules souches adultes. Ces organoïdes se développent quand les cellules souches sont dans des conditions environnementales appropriées qui vont leur permettre de s’organiser et de se différencier avec une morphologie semblable aux tissus ou aux organes dont elles proviennent. Les organoïdes dérivés de tumeurs de patients (aussi appelés tumoroïdes) sont similaires phénotypiquement et génotypiquement aux épithéliums tumoraux dont ils sont issus. Ils reproduisent l’hétérogénéité tumorale retrouvée au sein des tumeurs.
Dans cet article, des organoïdes sont produits à l’aide de deux techniques différentes que sont la culture à l’interface Air-Liquide et la technique de la goutte immergée, puis analysés par des techniques d’histologie ou d’immunofluorescence. Nous montrons que les organoïdes développés à partir de diverses parties de la zone transitionnelle de l’estomac de souris ou de glande mammaire humaine ressemblent histologiquement à leurs tissus d’origine.
Des tumoroïdes dérivés à partir de biopsies de patients atteints de cancer du rectum vont reproduire le stade de différenciation de la tumeur d’origine allant de la dysplasie de haut grade à l’adénocarcinome peu différencié.
Ainsi les organoïdes dérivés de tissus sains ou pathologiques sont de nouveaux modèles d’étude qui permettent de modéliser des maladies pour les étudier dans un environnement humain ou murin tridimensionnel et fonctionnel, et ce, avec des cellules spécifiques d'un patient ou avec des cellules de modèles murins. Les organoïdes seront un atout majeur dans le développement d’essai préclinique permettant de tester de nouvelles thérapies sur des organoïdes pathologiques humains avant de proposer des essais cliniques chez l'homme.

Introduction : Il existe un besoin thérapeutique important pour les formes sévères de lymphomes T cutanés (LTC). Le Mogamulizumab, anti-KIR3DL2 et la brentuximab vedotin (BV), un anticorps anti-CD30 de type antibody-drug conjugate (ADC) couplé à la monométhyl auristatine E (MMAE), ne permet que des réponses de courte durée. Inducible Co-Stimulator (ICOS) est un récepteur de costimulation lymphocytaire T impliqué dans le développement des LTC. Notre étude évalue son potentiel en tant que cible thérapeutique.
Matériel et Méthodes : L’expression d'ICOS était évaluée en immunohistochimie dans des biopsies cutanées de 23 patients atteints de mycosis fongoïde (MF) à un stade précoce, 12 de MF transformé (MFT) et 17 de syndrome de Sézary (SS). Les ganglions envahis de 5 patients ayant un SS étaient également analysés.
L'expression d'ICOS par les cellules de Sézary circulantes et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) des patients atteints de SS était évaluée par cytométrie en flux et comparée à des lymphocytes de donneurs sains (DS).
Nous avons ensuite étudié l'efficacité d’ADC anti-ICOS générés par le couplage d'anticorps monoclonaux anti-ICOS avec la MMAE et la pyrrolobenzodiazépine (PBD), et nous les avons comparés au BV. Pour cela, nous avons utilisé des lignées cellulaires de LTC ICOS+ (MyLa, MJ et HUT78), une xénogreffe murine (XM) avec la lignée MyLa, et une XM avec des cellules de Sézary issues d’un patient.
Résultats : ICOS était fortement exprimé dans l’infiltrat lymphocytaire tumoral chez respectivement 61%, 75% et 88% des patients atteints de MF, TMF et SS, ainsi que dans les 5 ganglions envahis. Le double marquage révélait que l'expression d'ICOS était limitée aux lymphocytes T tumoraux. Les lymphocytes T CD8+ICOS+du micro-environnement tumoral étaient rares. L'expression d'ICOS par les cellules de Sézary circulantes était forte : 69±7,3 % contre 38,8±7,1 % des LT CD4+ non tumoraux (p<0,009;IC95%:8,7-51,6) ; et 31±3,2% des LT CD4+ de DS (p<0,0001;CI95%:20,3-46,3). Les patients atteints de SS avaient significativement plus de Treg ICOS+ que les DS.
Sur les lignées de LTC, les ADC anti-ICOS-MMAE et anti-ICOS-PBD permettaient une diminution significative de la viabilité cellulaire. Dans le modèle de XM avec MyLa, la survie globale (SG) était plus longue dans le groupe ADC anti-ICOSMMAE que dans le groupe BV (HR=15,2;IC95%:3,2-71,1;p<0,0006). Enfin, dans la XM dérivée de patient, l’ADC anti-ICOS-MMAE améliorait significativement la SG et réduisait le nombre de cellules tumorales sanguines et médullaires. Aucune toxicité des ADC n'a été observée chez les souris traitées.
Discussion : ICOS est une cible prometteuse car elle est exprimée à la fois par les lymphocytes tumoraux et les Treg. Nous rapportons pour la première fois l'expression forte d'ICOS dans les LTC, ainsi que l'efficacité préclinique d’ADC antiICOS dans différentes conditions expérimentales. Ces résultats constituent la base
préliminaire d'un essai thérapeutique.

Nous avons identifié au laboratoire un nouveau biomarqueur pronostic de surface appelé nectine-4 exprimé dans le sous-type de cancer du sein triple négatif (TNBC) de mauvais pronostic. Les données d’immunohistochimie montrent une forte expression dans 62% des TNBC et une expression réduite dans les tissus sains. Un conjugué anticorps-médicament anti-nectine-4 (ADC) a été développé et montre une efficacité marquée dans des modèles précliniques TNBC primaires et métastatiques. Nous avons étudié in vivo les conséquences d’un traitement à long-terme avec notre ADC et identifié un mécanisme de résistance impliquant la protéine de multirésistance MDR-1/P-glycoprotéine (P-gp). Le traitement combiné avec un inhibiteur de P-gp permet de retrouver la sensibilité à l’ADC. Un médicament de type ADC de nouvelle génération ciblant nectine-4 est en cours de développement clinique

Il n'existe pas de tissu sans connexions neuronales et, par conséquent, les tumeurs malignes possèdent également une interface neuronale, indépendamment de l'endroit où elles apparaissent et se propagent. Les cellules cancéreuses et les cellules du système nerveux s'engagent dans un dialogue réciproque qui conduit souvent à une accélération de la progression de la maladie. La présence de fibres nerveuses dans le microenvironnement tumoral est donc apparue récemment comme un biomarqueur pronostique et une cible thérapeutique potentielle pour le traitement du cancer. Cet article présente une méthode permettant d'analyser l'organisation tridimensionnelle des réseaux neuronaux dans des échantillons de tissus intacts (non sectionnés). Nous illustrerons comment cette approche, appliquée à un modèle murin l'adénocarcinome pancréatique, permet de visualiser les différentes structures neurales présentes dans le microenvironnement tumoral (des grands faisceaux nerveux aux terminaisons axonales individuelles) et fournit des informations sur les mécanismes qui sous-tendent l'innervation tumorale

Le développement larvaire de la moule méditerranéenne Mytilus galloprovincialis est un modèle bien établi pour évaluer les effets des facteurs de stress environnementaux sur les invertébrés marins. Cependant, les processus régulant le développement larvaire chez les mollusques bivalves sont encore très peu connus. Nous avons conçu des protocoles d'hybridation in situ (HIS), d'immunomarquage et de colorations vitales pour étudier la biogénèse de la coquille et la neurogénèse, processus morphogénétiques extrêmement sensibles aux contaminants environnementaux et au changement climatique. La biogenèse de la coquille larvaire qui commence au stade trochophore précoce (24 heures post fécondation (hpf)) jusqu'au stade D-véligère (48 heures pf) est quantifiée par marquage avec les deux colorants vitaux Calcofluor et Calcéine qui, respectivement, colorent la matrice organique et la partie minérale de la coquille en croissance. Au cours de la même fenêtre de développement, la neurogénèse précoce a été étudiée avec des anticorps dirigés contre les neurotransmetteurs sérotonine (5-HT) et acide γ-aminobutyrique (GABA). En outre, des HIS ont été réalisées pour étudier l'apparition des neurones dopaminergiques (DOPA) et la population neuronale globale. Nos résultats montrent que la biogenèse de la coquille commence dès le stade trochophore et qu'à ce stade larvaire les moules présentent déjà une population neuronale qui comprend à la fois des cellules 5-HT et GABA positives, tandis que les neurones DOPA n'apparaissent qu'au stade pré-véligère. Chez les D-véligères, la coquille est en forme de D tandis que les neurones, en particulier 5-HT, sont organisés en proto-ganglions. Ces techniques et découvertes nous ont permis de démontrer des effets neurotoxiques ainsi que des effets directs sur la biogenèse de la coquille par des perturbateurs endocriniens connus.

Afin d’émettre des hypothèses sur l’origine et l’évolution des épithéliums, nous développons un modèle d’éponge appartenant à la classe des homoscléromorphes. Les éponges sont l’une des lignées ayant émergé le plus précocement au cours de l’évolution des animaux, elles constituent donc un groupe clé pour comprendre les premières étapes de l’évolution animale. Nous cherchons à caractériser les mécanismes moléculaires qui concourent à la mise en place des épithéliums dans notre modèle afin d’en déduire, dans une approche comparative, les mécanismes qui sont conservés à l’échelle des animaux et donc acquis très probablement chez leur dernier ancêtre commun et ceux spécifiques à notre modèle. Afin de répondre à ces questions fondamentales, nous nous appuyons sur un ensemble d'approches complémentaires : génomique et transcriptomique comparées, histologie classique, microscopie électronique, mmunofluorescence, biochimie et protéomique

Notre 36eme congrès accueille plusieurs sujets mettant en avant l’application de pratiques histologiques à la biologie végétale. Cet éditorial saisit cette occasion pour rendre hommage à Katherine Esau, pionnière et référence scientifique dans le domaine de la biologie végétale. Nous revenons sur les développements de la microscopie et la microdissection laser appliquées à l’étude du tissu végétal, une opportunité de mentionner aussi que depuis juin 2022, l’AFH diversifie sa palette d’actions de partage de connaissance et de mise en réseau en hébergeant le réseau national MicroLaserBiotech.

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