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Intelligence artificielle et analyse d’images histologiques : Opportunités et challenges

L’anatomopathologie remonte au 19ème siècle. Depuis, le matériel n’a cessé d’évoluer, mais l’œil expert du pathologiste reste incontournable. De même, le processus complet (préparation du tissu et des lames, coloration, contrôle qualité) consiste encore en beaucoup d’étapes manuelles. Grâce à l’avènement récent de scanners numériques à bon rendement, les lames d’histopathologie tissulaire peuvent maintenant être numérisées et stockées sous forme d’images numériques. Avec la disponibilité et l’analyse d’un ensemble beaucoup plus vaste de variables combinées à des techniques d’imagerie et d’analyse sophistiquées, le paradigme traditionnel du pathologiste et de la microscopie pourrait rapidement être remplacé par la pathologie numérique, s’appuyant sur une visualisation sur écran des coupes de tissus numérisées et une analyse combinant un pathologiste et un système d’aide au diagnostic informatisé.
En termes d’analyse d’images, d’immenses progrès ont aussi été faits récemment, notamment les travaux de Lecun et al. sur les réseaux de neurones convolutionnels et surtout le développement de réseaux de neurones de très grandes tailles (apprentissage profond) qui révolutionnent le domaine. En effet, ceux-ci ont surpassé l’ensemble des méthodes de traitement d’images existantes dans la plupart des domaines (segmentation, détection d’objets, classification). L’ensemble des méthodes actuelles appliquées à l’analyse d’images histopathologiques sera présenté ainsi que les enjeux et défis technologiques futurs de cette discipline.

Méthode et intérêt de la construction d’un tissue micro-array de 2232 cancers du sein

La technique du Tissue Micro-Array (TMA) permet d’inclure de nombreux tissus (cylindres biopsiques) dans un même bloc de paraffine. Elle permet ainsi d’étudier l’exploration ou la validation de biomarqueurs spécifiques, descriptifs (prévalence d’une anomalie, etc.), pronostiques ou prédictifs sur un grand nombre de tumeurs.
Cette technique permet de faire une analyse à grande échelle des échantillons, elle permet un traitement uniforme de tous les prélèvements, une préservation du bloc donneur (bloc d’origine) et un gain de temps et de réactifs. Elle présente toutefois des inconvénients :
- La sélection des cas et la construction sont des étapes assez longues
- La coupe des blocs TMA est moins aisée que des coupes entières
- Pour des TMA non aléatoires, risque de spots non analysables par effet de bord en IHC
- La lecture peut s’avérer fastidieuse sans l’acquisition d’un logiciel approprié.
Afin de disposer d’une base de données à grande échelle de tumeurs mammaires, cette technologie a été choisie et ce projet a été abouti au bout de 3 longues années.

Imagerie tri-dimensionnelle d’échantillons par une technique de serial block face imaging amovible

L’analyse tridimensionnelle d’un échantillon par Serial Block Face Imaging trouve ses champs d’application dans l’étude de la micro-anatomie et la biologie du développement. Le concept est de produire une grande quantité d’images directement à partir de la surface d’un bloc dans lequel est inclus l’échantillon, et ce, au fur et à mesure de sa coupe (au microtome ou cryostat). Les images sériées sont de fait déjà pré-alignées et permettent de reconstruire en trois dimensions l’échantillon et de l’explorer selon n’importe quel plan de coupe virtuel. La plateforme MicroPICell et la société Kaer Labs collaborent afin de reproduire cette technique, avec une caméra amovible comprenant une source d’excitation LED intégrée, positionnée en face d’un microtome ou d’un cryostat classique. A partir d’organes soit inclus en paraffine colorée soit congelés et enrobés dans de l’OCT, cette technique nous a permis d’acquérir des images en série grâce au contraste de fluorescence entre l’échantillon et le milieu d’enrobage. Nous avons pu ensuite faire une reconstruction 3D de ces échantillons, en conservant leurs structures. Par rapport aux systèmes commerciaux disponibles, ce système est peu onéreux, demande une préparation simple des échantillons et est adaptable aussi bien pour des échantillons inclus en paraffine qu’en congelé.

Evolution vers la 3ème dimension pour une meilleure compréhension du microenvironnement immunitaire dans les tumeurs

L’analyse du microenvironnement d’un tissu fournit une manne d’informations quasiment illimitées pour les chercheurs et les cliniciens. Les avancées très récentes des techniques d’immunohistochimie (IHC) et d’immunofluorescence (IF) ont permis de mieux appréhender la complexité du microenvironnement tissulaire notamment dans les cancers. Au travers de plusieurs exemples développés dans les cancers du poumon, les limites de l’IHC/IF ont été repoussées pour mieux répondre à des questions comme : est-ce que le niveau d’organisation in situ de l’infiltrat immunitaire est relié à la survie des patients? Est-ce que tous les dialogues cellulaires ont été décrits au site tumoral? Quid des interactions entre différents grands systèmes tels que les systèmes nerveux, vasculaire et immunitaire dans une tumeur? C’est ainsi que l’IHC et l’IF ont trouvé toute leur place en apportant des éléments de réponses majeures dans la compréhension du microenvironnement tumoral et de son hétérogénéité inter-patient. L’histo-technologie est en pleine révolution depuis les colorations, les simples marquages aux multiplexages en 2 dimensions sur coupes puis vers la 3ème dimension sur échantillons entiers. D’autres avancées technologiques sont déjà en marche avec la combinaison de l’IHC/IF à d’autres techniques existantes pour toujours plus de recherche d’informations à l’échelle individuelle.

Tests immunohistochimiques en immuno-oncologie clinique : du rêve à la réalité

Les succès obtenus par l’immunothérapie dans plusieurs types de tumeurs ont renouvelé l’intérêt pour l’étude de la réponse immune anti-tumorale et suscitent la recherche de nouveaux marqueurs pronostiques et prédictifs. L’immunohistochimie est une des principales approches utilisées pour répondre à ces questions. L’immuno-oncologie clinique a stimulé le développement de nouvelles techniques et de nouvelles stratégies, visant à fournir des informations multiparamétriques, quantitatives et fonctionnelles, en couplant une immunohistochimie de nouvelle génération avec des outils de traitement d’image et de bio-informatique. Même si, à l’heure actuelle, les tests utilisés pour la prise en charge des patients sont peu nombreux, il faut dès à présent se préparer pour être capable, demain, de transférer les nouvelles technologies issues de la recherche vers la pratique clinique et le diagnostic.

Analyse du micro-environnement tumoral comparaison cytométrie en flux et histologie

Avec l’avènement des produits d’immunothérapie, l’analyse du microenvironnement tumoral (TME) est devenue essentielle. Cette caractérisation est nécessaire pour expliquer le mode de fonctionnement de ces produits, pour éventuellement expliquer leur potentielle toxicité et surtout pour tenter de stratifier les patients qui auront accès à ces nouvelles thérapies. Pour cette analyse du TME, différentes techniques existent, avec leurs avantages et leurs inconvénients. Dans cette présentation, nous avons étudié les atouts et les limites des techniques que nous utilisons au quotidien : l’immunohistochimie multiplexe quantitative et l’analyse par cytométrie de flux. Nous avons comparé ces deux techniques sur des échantillons communs et sur différents marqueurs de cellules immunitaires. Les paramètres que nous avons étudiés sont : la quantification absolue de marqueurs intra-tumoraux, l’étude des proportions relatives des cibles par analyses multiplexes et la localisation de ces marqueurs. Nous avons également comparé les marqueurs utilisés dans ces deux techniques sur deux populations tumorales murines distinctes. Les résultats obtenus nous ont permis de comparer ces deux techniques qui restent complémentaires. Ces différences sont importantes à connaître, surtout dans le paysage de l’immunothérapie, pour déterminer la méthode la mieux adaptée aux questions scientifiques qui nous sont posées par nos clients chercheurs qui développent de nouvelles thérapies.

Micro-environnement tumoral et immunothérapie

Nous vivons actuellement une révolution dans la prise en charge thérapeutique des cancers avec l’avènement de l’immunothérapie. La première ligne de ces nouveaux traitements sont les « Immune Checkpoint Inhibitor » (ICI), des anticorps monoclonaux qui suppriment l’inhibition du système immunitaire induite par la tumeur, comme les anti PD-1 et anti PD-L1. Dès la conception de ces médicaments, la nécessité de mettre en évidence les cibles thérapeutiques est apparue essentielle pour stratifier les patients. C’est pourquoi des tests compagnons ont été développés, et ces tests sont des techniques d’immunohistochimie (IHC). En effet, les cibles thérapeutiques sont au sein même des tumeurs et il faut non seulement les mettre en évidence, mais de plus en plus contextualiser globalement le microenvironnement tumoral (TME : « Tumor MicroEnvironment »). Ces études du TME ont montré que sa composition était prédictive des réponses thérapeutiques, même au-delà des immunothérapies. De ces constatations se sont développés des tests IHC prédictifs, comme l’Immunoscore® dans le cancer du côlon. Mais nous ne sommes qu’au début de cette révolution, et le nombre d’immunothérapies se multiplie, et bien sûr le nombre de cibles également. Toutes ces stratégies auront besoin dans les années à venir de biomarqueurs in situ pour expliquer leurs modes de fonctionnement, leurs potentielles toxicités, mais également de biomarqueurs de sélection des patients. L’étude de la complexité du TME et la diversité des immunothérapies en cours de développement vont bénéficier de l’utilisation des nouvelles techniques d’immunohistochimie multiplexes en pleine évolution.

Différenciation et culture tridimensionnelle de neurones sensoriels humains et de cellules de Schwann dans un modèle de peau reconstruit par génie tissulaire

Les micro-organismes pathogènes, des substances chimiques et des maladies auto-immunes peuvent stimuler l’activation de neurones sensoriels dans la peau. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier ces réactions de manière fiable. Notamment, les modèles existants n’ont généralement pas de barrière épidermique, qui est nécessaire aux expériences portant sur l’application topique de substances. Ceci représente un défaut important qui limite les évaluations pré-cliniques de médicaments, d’adjuvants vaccinaux ou de substances chimiques potentiellement irritantes. Pour pallier ce manque, nous avons développé un modèle de peau humaine reconstruite par génie tissulaire comprenant une innervation générée à partir de ganglions de la racine dorsale provenant d’embryons de souris. Ici, nous décrivons un nouveau protocole permettant la différenciation de neurones et de cellules de Schwann à partir de cellules souches induites pluripotentes humaines, et leur incorporation dans un modèle 3D de peau. La structure des co-cultures créées ainsi et les marqueurs permettant de caractériser les différents types cellulaires ont été évalués en détail. Ce nouveau système est actuellement utilisé dans nos études des interactions neuro-immunitaires dans la peau et dans la prédiction de leur rôle dans la toxicité cutanée, l’angiogenèse et l’inflammation.

Dynamique des hétéromères opioïdes mu-delta en conditions physiopathologiques : aspects techniques

Le système opioïde module de nombreuses fonctions physiologiques et le récepteur mu est responsable des effets analgésiques et euphorisants des opiacés. Des interactions fonctionnelles entre récepteurs mu et delta par l’intermédiaire d’hétéromères impliquant ces deux récepteurs ont été proposées. Les propriétés de signalisation et de trafic des hétéromères mu-delta ont été étudiées de façon intensive en cellules transfectées mais peu de données sont disponibles concernant leur impact fonctionnel in vivo ou leur distribution dans le système nerveux. En utilisant des souris double knock-in co-exprimant des récepteurs mu et delta fluorescents fonctionnels, nous avons cartographié la co-localisation neuronale des deux récepteurs dans le système nerveux en conditions basales et pathologiques. Nous décrirons ici les améliorations techniques développées pour une visualisation optimale des deux récepteurs.

Analyse histologique d’explants vestibulaires pour évaluer la toxicité de produits chimiques

De nombreuses études épidémiologiques et expérimentales ont montré que les expositions professionnelles à des solvants peuvent engendrer des troubles de l’audition chez l’Homme comme chez le rongeur de laboratoire. Alors que l’organe périphérique de l’équilibre, le labyrinthe vestibulaire, se trouve dans l’oreille interne, et qu’il présente des similarités morphologiques et fonctionnelles avec la cochlée, aucune information n’est disponible sur les effets néfastes des solvants sur ce récepteur. Pourtant, des données épidémiologiques suggèrent que des expositions professionnelles aux solvants peuvent engendrer des troubles de l’équilibre pouvant être à l’origine de chutes. Dans cet article, nous décrivons les méthodes permettant d’évaluer la vestibulotoxicité périphérique en utilisant un modèle de « cyste » : sphère remplie d’endolymphe obtenue à partir d’échantillons de vestibule (utricules et ampoules) prélevés sur des rats nouveau-nés avant d’être mis en culture. La mesure de la concentration endolymphatique en potassium et l’étude histopathologique des « cystes » permettent de comprendre les mécanismes de toxicité et d’identifier les cibles cellulaires lors d’une exposition à un produit chimique, un solvant aromatique en l’occurrence. Les caractéristiques fonctionnelles et morphologiques des cystes obtenus à partir d’utricules et d’ampoules sont observées puis la fonctionnalité du modèle est évaluée à l’aide de molécules dont les effets sont connus : l’ouabaïne, un bloqueur des pompes Na+/K+ ATPase, la gentamicine un antibiotique cytotoxique pour les cellules ciliées vestibulaires, et enfin le styrène, un solvant aromatique utilisé en milieu industriel et dont les propriétés cochléotoxiques sont bien connues.

Etude histologique du foie, de l’intestin et de la rate de souris infestées à Schistosoma mansoni puis soumises à un traitement suppressif à l’extrait aqueux de Sida pilosa Retz

La schistosomiase demeure un réel problème de santé publique dans les pays tropicaux. La pathologie à Schistosoma mansoni est principalement causée par les œufs qui, embolisés dans le foie et l’intestin, sont à l’origine d’une nécrose tissulaire, de la mise en place d’une réaction inflammatoire granulomateuse pouvant évoluer vers une fibrose et d’un dysfonctionnement tissulaire. L’utilisation intensive du praziquantel, unique médicament contre toutes les formes de schistosomiase, est parfois à l’origine d’échecs thérapeutiques et pourrait conduire à une résistance du schistosome. Cette étude a été entreprise pour évaluer par analyse histologique l’effet préventif de l’extrait aqueux des parties aériennes de Sida pilosa (SpAE) sur la mise en place de la pathologie à Schistosoma mansoni chez la souris. Après infestation des souris mâles, elles ont été traitées quotidiennement à SpAE du jour 1 au jour 28 post-infection (p.i.) aux doses de 100 et 200 mg/kg. Les souris ont été sacrifiées au jour 56 p.i.. Les effets de SpAE sur l’installation des pathologies hépatique, intestinale et splénique ont alors été évalués. Pour ce faire, le foie, l’intestin grêle et la rate ont été fixés dans le formol 10 % tamponné puis des coupes de 5 µm réalisées. Le foie et l’intestin ont été colorés à l’hématoxylineéosine afin d’évaluer les infiltrations leucocytaires et la réaction granulomateuse. La coloration au Picrosirius a été entreprise pour la mise en évidence du collagène et la coloration au Periodic Acid Schiff (PAS) pour visualiser les structures glycoprotéiques du parasite. La coloration de Perls a été effectuée sur des coupes de rate pour la mise en évidence d’hémorragies tissulaires à travers la présence de sidérophages. Le traitement à SpAE a prévenu l’infiltration des cellules inflammatoires dans le foie des souris à 56 jours p.i. Le nombre et la taille des granulomes au niveau des parenchymes hépatique et intestinal étaient ainsi considérablement réduits. L’effet de cet extrait de plante a été également marqué par la diminution du dépôt de collagène au niveau des foyers granulomateux. Une présence plus importante de sidérophages a été notée sur la rate des animaux infestés et non traités comparativement à celle des animaux infestés puis traités à SpAE. Cette étude confirme l’inefficacité du praziquantel sur les stades larvaires de Schistosoma mansoni et démontre que l’extrait aqueux des parties aériennes de Sida pilosa préviendrait considérablement l’installation de la pathologie à Schistosoma mansoni.

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