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Valorisation de la revue française d’histotechnologie - La revue française d’histotechnologie : état de l’art, visibilité et améliorations pressente et future de cette visibilité

Dans un contexte de changement profond de l’édition scientifique, nous faisons ici un point sur notre Revue, vecteur original de partage de données et de connaissances histotechnologiques entre experts issus de la communauté francophone, à la fois sur l’existant mais aussi sur les moyens pour la rendre plus visible. Nous avons entamé de nombreuses démarches qui sont présentées dans cet article spécial et qui devraient contribuer à marquer un tournant dans l’histoire de notre Revue. L’attractivité et la visibilité de notre Revue devraient s’en trouver grandies.

Un premier pas vers l'étude du collagène du cartilage articulaire en microscopie électronique

Le cartilage articulaire est un tissu très spécialisé recouvrant la surface des os impliqués dans les articulations diarthrodiales et permet des mouvements avec peu de friction en facilitant la transmission des charges à l’os sous-chondral. Etant donné le nombre croissant de patients souffrant de pathologies telles que l’ostéoarthrite et l’arthrite rhumatoïde, l’étude du cartilage articulaire prend de plus en plus d’importance. Le cartilage articulaire est un sujet de choix pour être étudié par une technique d’imagerie de haute résolution comme la technique de microscopie électronique à transmission (MET). Mais cette approche est complexe due à la prépondérance de la matrice extracellulaire, composée essentiellement de protéoglycanes et de collagène et qu’il est très difficile de préserver et colorer pour en extraire des informations sur son ultrastructure. Afin de vérifier notre méthodologie pour reproduire des données déjà disponibles sur l’imagerie du cartilage par MET, et ainsi corréler les images avec le contenu en collagène, nous avons appliqué la MET à l’étude du ménisque et du plateau cartilagineux fémoral d’une articulation du genou de la patte postérieure d’un rat adulte. Grâce à la préparation classique du tissu pour la MET focalisant sur la préservation du collagène au détriment des protéoglycanes, nous avons pu reproduire les données publiées et différencier les deux tissus en fonction de leur type de collagène prépondérant. La prochaine étape de notre travail sera d’utiliser ces images de MET pour valider les images de microscopie électronique à balayage (MEB) que nous aimerions générer à partir des mêmes tissus.

Caractérisation des macrophages dans un modèle de muscles porcins irradiés

Gérer l'inflammation et améliorer la régénération tissulaire après une blessure est un enjeu primordial, d'intérêt non seulement scientifique mais aussi clinique. Bien que de nombreuses cellules soient impliquées dans l'inflammation, les macrophages semblent jouer un rôle important dans la régénération tissulaire. Cependant, les mécanismes impliqués doivent être approfondis. Il a été démontré que des injections locales de cellules souches issues du tissu adipeux (ASC) pouvaient réduire l’inflammation et améliorer la régénération tissulaire. Chez un modèle porcin irradié localement avec 50 Gy de rayons gamma, nous avons constaté, à 76 jours post-irradiation, une fibrose intensive dans les échantillons irradiés non traités avec ASC (Témoin). Contrairement à cela, dans les tissus irradiés et traités avec des ASC (Traité), nous avons démontré la diminution de la fibrose et l’amélioration de la régénération musculaire. L'identification des sous-populations de macrophages, tout en ciblant la polarisation de ces derniers, pourrait être utilisée comme nouvelle stratégie diagnostique ou thérapeutique pour la régénération tissulaire. La caractérisation des macrophages a été réalisée par immunomarquage en comparant les tissus Témoins avec les tissus Traités. Étonnamment, nous avons principalement identifié des macrophages M1 et quelques macrophages M2 dans les muscles Traités-2 et 3. Dans le muscle Traité-1, aucun macrophage n’a été localisé, la régénération musculaire était probablement déjà terminée dans ce muscle. Une absence de macrophages a aussi été observée dans les tissus Témoins-2 et 3 contrairement au tissu Témoin-1 dans lequel seulement quelques macrophages M2 ont été détectés. L'Interleukine-6 (IL-6) est une cytokine multifonctionnelle qui régule les réactions immunitaires et peut jouer un rôle central dans les mécanismes de défense de l'hôte. Nous avons remarqué que les macrophages M1 et M2 ont montré une forte expression d’IL-6 et une faible mais détectable expression d’IL-1ßdans les muscles Traités-2 et 3. L’IL-6 diminue la production d’IL-1 et stimule la production de molécules intervenant dans les processus de réparation tissulaire.

L'application des techniques d'immunohistochimie à des prélèvements cytologiques: quelques règles à respecter

L’immunocytochimie (ICC) constitue une aide précieuse pour affiner le diagnostic cytologique. Cependant sa réalisation est parfois limitée par des problèmes de reproductibilité. Une des contraintes est représentée par la diversité des échantillons et de leur préparation. L’harmonisation des étapes préanalytiques constitue un pré-requis indispensable afin d’obtenir une bonne reproductibilité. Les résultats obtenus seront différents selon que l’on travaille sur lame d’étalement, sur cytospins ou bien à partir de prélèvements fixés en milieu liquide. Il est possible d’harmoniser la fixation de lames d’étalement ou de cytospins avant la technique d’ICC. Il sera nécessaire de connaitre la nature du fixateur s’il s’agit d’un milieu liquide. En effet, le formol justifiera un démasquage antigénique préalable. Certains anticorps nécessiteront obligatoirement un démasquage antigénique, notamment pour les antigènes nucléaires, cela ne sera pas systématiquement nécessaire pour des antigènes membranaires ou cytoplasmiques. Les techniques de démasquage devront être ajustées à la cytologie (temps plus courts avec les pH élevés). Nous présenterons quelques exemples à partir d’anticorps fréquemment utilisés en cytologie.

Apports des techniques spectroscopiques en biologie végétale

Si les techniques spectroscopiques basées sur les très grandes infrastructures de recherche (TGIR) sont couramment utilisées dans des disciplines telles que la physique ou encore les sciences des matériaux, elles sont moins répandues chez les biologistes. Elles permettent pourtant d’accéder à des informations qui peuvent faire grandement avancer notre compréhension des mécanismes biologiques. La micro-spectroscopie par fluorescence X (µXRF) basée sur le rayonnement synchrotron permet de réaliser des cartographies élémentaires avec une résolution latérale pouvant descendre à quelques centaines de nanomètres et une grande sensibilité. En parallèle à la µXRF, certaines lignes de lumière au synchrotron permettent de coupler la micro-spectroscopie d’absorption des rayons X (µXAS). Grâce à cette technique, on peut sonder la structure de l’élément d’intérêt et déterminer en particulier son état d’oxydation et ses ligands. C’est par exemple très utile en écotoxicologie pour comprendre le comportement et le devenir d’un contaminant pour mieux évaluer son impact sur l’environnement ou en agronomie pour enrichir des cultures en éléments minéraux. Ces techniques sont cependant extrêmement tributaires d’une bonne préparation d’échantillons. Depuis une dizaine d’années environ, de nombreux progrès ont été fait tant sur l’équipement des lignes de lumière que sur les techniques de préparation d’échantillons pour prendre en compte la nature particulière des échantillons biologiques (hautement hydratés, fragiles et sensibles aux rayonnements). Ces différents points seront développés au travers de l’exemple de plantes (Lactuca sativa, salade) exposées à un apport foliaire en fer avec ajout de nanoparticules d’argent.

Mise au point d'une technique d'immunohistochimie multiplex quantitative pour l'analyse du microenvironnement immunitaire tumoral

Le contexte immunitaire influence la progression tumorale et le devenir des patients sous thérapies antitumorales. Plus précisément, le microenvironnement tumoral (TME) influence la progression des tumeurs et est désormais la cible des nouvelles immunothérapies. L’étude de cet environnement est désormais indispensable pour accompagner les traitements des patients. L’objectif de cette étude est de développer et d’évaluer des panels d’immunohistochimie (IHC) multiplex pour analyser le TME. L’IHC multiplex peut permettre d’analyser la complexité du TME et d’étudier directement in situ les interactions entre les nombreuses populations cellulaires qui le composent. Dans cette étude préliminaire, nous avons développé un panel pour l’analyse des lymphocytes infiltrants la tumeur (TIL), et réalisé une évaluation de la méthode d’analyse des images. La méthode utilisée est une IHC multiplex révélée en immunofluorescence (IF) avec le système d’amplification du signal à la tyramide (TSA) développé par Perkin Elmer sous le nom de système Opal suite à un partenariat. Cette technologie a été notamment adaptée sur l’automate Leica BOND RXm utilisé pour cette étude. Pour l’analyse des TIL, nous avons développé un panel CD4, CD8 et CD20 permettant de cibler respectivement les lymphocytes T helper, T cytotoxiques et B. Après l’IF multiplex et le scan des lames, les marqueurs ont été quantifiés par analyse d’image en utilisant le logiciel CaloPix de Tribvn. La méthode d’analyse a été évaluée en étudiant la justesse des résultats quantitatifs obtenus en multiplex par rapport aux analyses simples et la reproductibilité du process, réalisé par plusieurs opérateurs. Ces analyses ont été faites sur plusieurs types tumoraux : cancer du poumon (NSCLC), du sein (BC) du pancréas (PC), du cerveau, un glioblastome (G) et un cancer du foie (HCC). La variabilité induite par la nature de l’échantillon a également été adressée. Résultats : Nous avons observé que la justesse de l’analyse multiplex est impactée par le type tumoral étudié. Une bonne correspondance entre les simplex et le multiplex est observée pour les BC, PC et NSCL, mais est plus difficile à obtenir pour le Glioblastome et le HCC. La reproductibilité est également impactée par la nature du tissu. Ces premiers résultats montrent que la standardisation de la méthode d’analyse reste à parfaire pour diminuer ces variations. 163 Revue Française d’Histotechnologie 2018 - Vol. 30 - n°1 En conclusion, le développement de nouveaux biomarqueurs in situ est fondamental pour comprendre le fonctionnement du microenvironnement tumoral et des nouveaux produits d’immunothérapie. Nous décrivons ici un exemple de développement d’IHC multiplex quantitative, outil qui sera essentiel pour analyser le système immunitaire in situ et pour accompagner les traitements des patients. Nous soulignons également que les méthodes d’analyses de ces IHC nécessiteront des process de validations à ne pas négliger avant une utilisation automatisée.

Etude histologique des effets de l'extrait aqueux des feuilles de Laportea aestuans sur la régénération osseuse chez le rat

Laportea. aestuans (Urticacea) est une plante utilisée dans la région du Centre Cameroun pour le traitement des fractures. La présente étude a pour but d’évaluer par analyse histologique les effets ostéo-inducteurs de l’extrait aqueux des feuilles de L. aestuans chez la rate (Wistar). Une cavité a été créée dans la portion antérieure de la diaphyse du fémur. L’extrait aqueux de L. aestuans a été administré quotidienne par voie orale (100-400 mg/kg) pendant deux semaines. Au terme de la période expérimentale, les animaux ont été sacrifiés et les fémurs fixés dans du formol 10% tamponné puis transférés dans de l’éthanol à 70%. Ils ont ensuite été déshydratés et inclus en paraffine. Des coupes de 5µm ont été réalisées et les colorations suivantes faites : - H&E - Picrosirius et observation en lumière polarisée. Les animaux fracturés ne recevant aucun traitement ont présenté une structure 150 Revue Française d’Histotechnologie 2018 - Vol. 30 - n°1 osseuse désorganisée avec la présence d’ostéoblastes et d’ostéocytes dans leurs lacunes. En lumière polarisée ces animaux ont présenté un aspect d’«os tissé» se traduisant par une trame collagénique peu organisée et une faible minéralisation. Les animaux traités à l’extrait de plante ont présenté une structure du cal osseux de plus en plus dense avec plus ostéoblastes et de plus en plus d’ostéocytes dans les lacunes à toutes les doses. En lumière polarisée et à la dose de 400 mg/kg d’extrait de plante, les animaux ont montré un début d’organisation lamellaire parallèle au sein de l’os tissé. L’extrait induirait une activation ostéoblastique, conduisant à une réparation osseuse plus rapide, ce qui justifierait son utilisation empirique dans le traitement des fractures.

L'analyse histologique du tissu osseux et cartilagineux

Les techniques d’analyse histologique des tissus calcifiés font appel à des équipements et des protocoles de préparation spécifiques de ces échantillons. Notre Unité de recherche BIOSCAR est réfèrent de ces techniques sur l’os et le cartilage dans les modèles murins mais aussi pour le diagnostic en pathologie osseuse chez l’homme. Nous proposons ici un éventail des techniques en histologie sur les tissus osseux et cartilagineux. Nous discuterons de la pertinence du choix du fixateur selon la question scientifique posée, mais aussi des particularités techniques de la préparation des échantillons osseux et cartilagineux.

Myopathie de Duchenne/Becker: apport de la microscopie à force atomique

Les myopathies de Duchenne et de Becker sont des maladies génétiques dégénératives causées par l’absence ou des mutations de la protéine musculaire appelée dystrophine. Cette protéine est indispensable au maintien de l’intégrité de la cellule musculaire lors des cycles d’élongation/contraction. Malgré de nombreuses connaissances au niveau clinique, la littérature livre peu d’informations sur les mécanismes moléculaires de l’activité de la dystrophine notamment concernant le très grand domaine central de cette protéine. Nous nous sommes intéressés aux possibles interactions entre ce domaine central et la membrane plasmique en utilisant des méthodes biochimiques et biophysiques basées sur des systèmes modèles membranaires et sur des fragments purifiés du domaine central de la dystrophine. Par une analyse systématique, nous avons mis en évidence des caractéristiques spécifiques à certains fragments tout le long de ce domaine central. Ils éclairent l’importance des interactions avec la membrane dans la préservation de l’édifice membrane/dystrophine lors de l’activité musculaire.

Utilisation de sondes LNA pour la détection in situ de micro-ARNs dans le muscle squelettique de chien dystrophique

Les micro-ARNs (miRNAs) sont des ARNs de très petite taille capables d’induire l’extinction de l’expression de gènes par des mécanismes de régulation posttranscriptionnelle. Des altérations de l’expression de ces micro-ARNs sont décrites dans de nombreuses maladies. Ces petites molécules suscitent l’intérêt de la communauté scientifique dans la recherche de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques. Des outils techniques ont dû être développé et adapté à l’exploration des miRNAs. C’est le cas de l’hybridation in situ (HIS), la technique histologique de réference pour la visualisation des acides nucléiques sur coupes tissulaires. Par l’utilisation de sondes LNA (Locked Nucleic Acid) hautement spécifiques, notre équipe a étudié le profil d’expression des miR-206 et miR486 dans le muscle biceps fémoral du chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), représentant le modèle animal cliniquement pertinent de la dystrophie 94 Revue Française d’Histotechnologie 2018 - Vol. 30 - n°1 musculaire de Duchenne (DMD). Alors que l’analyse quantitative par RT-qPCR ne révèle aucune différence statistiquement significative de l’expression de ces 2 miARNs entre les chiens malades et sains, de façon importante, l’hybridation in situ démontre des profils d’expression bien distincts au niveau cellulaire avec une très forte expression dans les myoblastes et les fibres nouvellement régénérées chez le chien GRMD.

CRISPR/CAS9 et genèse d'animaux transgéniques

La technologie CRISPR-Cas9, apparue en 2012, a connu un développement très rapide en raison de sa facilité d’emploi, son efficacité et de son coût modéré. Elle a permis la démocratisation de l’édition de gènes dans un grand nombre d’espèces. Ces outils fonctionnent comme des ciseaux moléculaires extrêmement précis et engendrent une cassure double-brin de l’ADN au niveau de la séquence ciblée. Cette cassure entraine l’activation de voies de réparation qui facilite l’introduction de modifications génomiques (Knockout, knock-in). Sur la plateforme Transgenèse Rat ImmunoPhénomique (TRIP) à Nantes, nous générons des rats génétiquement modifiés grâce à ces nouveaux outils par microinjection ou par électroporation dans l’embryon unicellulaire. Nous en caractérisons la modification génétique. Une fois la lignée établie, le phénotype pourra être analysé, entre autres, par les techniques d’histologie appropriées. Parmi nos projets, nous avons généré, chez le rat, des modèles pour la myopathie de Duchenne, la mucoviscidose ou l’immunodéficience. Les nouveaux outils d’édition du génome permettent des modifications génétiques précises mais variées, offrant à la communauté scientifique des possibilités immenses de modèles d’études.