Le plastique a envahi nos vies personnelles et professionnelles depuis les années 1950. Les laboratoires ne sont pas épargnés et sont même de très gros consommateurs de ce matériau devenu problématique. Depuis son apparition dans nos vies, le plastique s’accumule partout dans l’environnement, sous forme de déchets visibles mais aussi moins visibles, sous forme de micro- et nano plastiques. Ces déchets persistants provoquent des dommages sur les êtres vivants et tous les écosystèmes. Dans les laboratoires de recherche, comme ailleurs, il est urgent de réagir et de mettre en application des solutions qui combinent la baisse immédiate de la consommation de plastique avec une meilleure gestion des déchets. Il n’y a plus le choix, il faut apprendre à s’en passer le plus possible et à mieux le gérer, même dans nos pratiques professionnelles, mais comment ?
Cette question a fait l’objet d’une table ronde au cours du 37e congrès de l’AFH, accueilli à Saint-Malo en juin 2024. Cet article redonne quelques éléments clés de ce contexte qui a servi de base pour animer deux sessions, organisées sous la forme d’un atelier ludique, en petits groupes, afin de permettre d’échanger, partager, débattre autour de l'importance de l'utilisation responsable du plastique en laboratoire d'histologie tout en encourageant la réflexion sur des solutions durables.

Qui n’a pas déjà tenté de mettre au point un anticorps primaire en immunohistochimie sans succès ? Qui ne s’est pas déjà demandé s’il disposait des bons contrôles et de la bonne méthodologie pour valider la spécificité
d’un anticorps en immunohistochimie ? Quand on sait que 50 % des anticorps commerciaux ne reconnaissent pas leurs cibles, il est important d’avoir les bons réflexes.
Ces tables rondes étaient organisées dans le but d’échanger sur les pratiques courantes des laboratoires pour mettre au point des immunomarquages à l’aide d’anticorps (Ac). Il s’agissait de partager des outils et des astuces qui permettent de garantir la bonne spécificité et qualité d’un marquage immunohistochimique (IHC). Pour les marquages immunofluorescents (IF), seules les méthodes de réduction de l’auto-fluorescence ont été abordées en fin de table ronde.

Les anticorps sont des outils indispensables pour l’étude, la caractérisation de molécules et la compréhension de mécanismes biologiques. La technologie des hybridomes, mise au point par Köhler et Milstein, a révolutionné les méthodes d’étude et d’analyse en permettant de disposer d’anticorps monoclonaux reproductibles et performants. Initialement utilisés pour le diagnostic, leur usage thérapeutique a rapidement été mis en place, favorisant l'innovation technologique dans leur obtention. Créés à la suite d’une immunisation de rongeurs, ils ont rapidement évolué pour générer des anticorps monoclonaux humains, souvent plus spécifiques. La technologie du phage display et la création d’anticorps recombinants ont permis d’étendre les possibilités de sources d’anticorps, aussi bien en termes d’espèces que de formats. Parallèlement, de nouvelles molécules chimiques telles que les quantum dots offrent de nouvelles possibilités pour l’imagerie. Enfin, les outils d’édition du génome permettent d’améliorer la fonctionnalité des anticorps monoclonaux déjà bien caractérisés tout en garantissant leurs spécificités, sans modifier les outils de production déjà en place.

La plateforme MACSima (Miltenyi) est un dispositif d'imagerie couplant un immunomarquage hyperplex séquentiel, jusqu'à 200 marqueurs sur une seule et même coupe de tissu, avec l'acquisition automatique des signaux et un logiciel d'analyse d'images. Nous avons utilisé cette technologie pour identifier les types cellulaires et leurs interactions durant la parturition, qui est l'ensemble des processus biologiques et mécaniques qui conduisent au travail et à l'accouchement à la fin de la grossesse. Aujourd’hui encore, les mécanismes moléculaires liés spécifiquement au déclenchement du travail restent méconnus dans l’espèce humaine. Ce manque de connaissances empêche la progression dans la prise en charge, la prévention et la prédiction de la prématurité en particulier, qui est un enjeu de santé publique. Dans cet article, nous traiterons de l’équipement MACSima et des points de vigilance quant à son utilisation. Nous présenterons les résultats préliminaires obtenus avec un panel de 46 anticorps conçu pour caractériser in situ les cellules myéloïdes, les lymphocytes et leur microenvironnement à l'interface fœto-maternelle, sur des échantillons de membranes fœtales recueillies chez des femmes à terme ayant accouché par une césarienne avant travail.

La détection simultanée de l’expression de gènes et de protéines sur un tissu était un réel défi technologique pour les histologistes. Cependant, étant donné l’importance d’identifier l’expression d’un gène et la co-localisation de protéines utilisées comme des marqueurs spécifiques de certains types cellulaires ou de certaines voies d’activation par exemple, nous avons vu ces dernières années se développer des techniques combinées d’hybridation in situ et d’immunohistochimie. La difficulté a donc été levée, par exemple par la combinaison de deux technologies, d’une part la technologie du RNAscope® fournie par Advanced Cell Diagnostics (ACD) qui permet la détection et l’évaluation de profils d’expression d’ARN messagers dans des cellules identiques ou adjacentes en utilisant un puissant système d’amplification couplé à une révélation chromogénique ou fluorescente, et d'autre part à une technique classique d’immunohistochimie.
Dans le but de classifier la microglie en différentes sous-populations, nous avons pu mettre au point une technique multiplex permettant la mise en évidence de l’expression de 4 gènes couplée à la détection de 2 protéines, sur des coupes de moelle épinière de souris, fixées et incluses en paraffine, d’un modèle transgénique de sclérose latérale amyotrophique (SLA), présentant une mutation au niveau du gène de la superoxide dismutase (SOD1G93A). Nous présenterons ici la démarche qui a permis d’aboutir à une technique validée et reproductible.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC), responsable de 800 000 décès annuels dans le monde, survient généralement chez des patients atteints de maladies hépatiques chroniques fibro-inflammatoires. Malgré les progrès contre les hépatites B et C, l’incidence du CHC augmente, notamment en raison de la forte prévalence de l’obésité, associant la stéatose hépatique aux dysfonctions métaboliques. En raison de son hétérogénéité, sa réponse aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaire reste limitée. Malgré une architecture très cellulaire, 30 % des CHCs contiennent des foyers de fibrose intra-tumorale. Ces foyers sont enrichis en cellules cancéreuses souches et progénitrices, avec une faible différenciation cytoarchitecturale et une expression de marqueurs d’évolution péjorative des patients. Après une étude de protéomique quantitative de la matrice extracellulaire (MEC) des CHCs, nous avons recouru à l’immunohistochimie multiplex pour étudier les relations topographiques entre plusieurs cibles moléculaires sur des tissus congelés non fixés d’archive (≥ 15 ans à -80 °C). Nous avons établi une preuve de concept sur trois CHCs. Parmi les 13 protéines étudiées, 10 étaient des composants de la MEC choisis en raison de leur valeur prédictive de l’agressivité tumorale et trois en tant que repères topographiques identifiant, respectivement, les fibroblastes associés au cancer (CAFs), les cellules endothéliales et les leucocytes. L’acquisition d’images a mis en évidence des nodules de cellules tumorales entourés par une maille d’élastine, fibrilline-1, périostine, collagènes de type I et V, contenant la chimioquine CXCL13 ou le facteur de croissance GDF15. Les leucocytes et les CAFs s’associaient à ces assemblages, entourant les nodules tumoraux richement vascularisés. En conclusion, l’immunohistochimie multiplex permet des analyses corrélatives et de proximité qui révèlent l'organisation topographique du microenvironnement tumoral.

L’incidence de la stéatose hépatique, ou maladie du foie gras, augmente rapidement à l’échelle mondiale, en particulier dans les pays industrialisés, en raison de la consommation généralisée de régimes riches en calories et de modes de vie sédentaires.
Dans certains cas, cette condition évolue vers une forme inflammatoire plus sévère, la stéatohépatite, augmentant considérablement le risque de développer un carcinome hépatocellulaire (CHC). Nos recherches portent sur l’impact de la consommation d’alcool chez les patients atteints de CHC associé à des troubles métaboliques. Plus précisément, nous étudions la présence et la distribution spatiale des cellules immunitaires dans les foies tumoraux, car leur localisation pourrait influencer les stratégies thérapeutiques. Pour cela, nous utilisons une technologie innovante de microscopie à immunofluorescence multiplex (mIF), appelée Cell Dive™, qui permet d'évaluer simultanément de nombreux marqueurs protéiques dans une seule section de tissu. Cette méthode repose sur des cycles itératifs d’hybridation d’anticorps fluorescents, suivis de l’extinction de la fluorescence avant le cycle suivant. Actuellement, nous avons développé un panel d’imagerie mIF de 24 marqueurs sur une seule lame histologique de patient, nous permettant de caractériser les sous-populations de cellules immunitaires et leur localisation dans le foie. Cette approche fournit des informations précieuses qui pourraient guider des stratégies thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints de CHC.

Les techniques d’immunomarquages permettent la mise en évidence de la localisation in situ de protéines, qu’elles soient tissulaires ou cellulaires, cytoplasmiques, membranaires ou nucléaires, et spécifiques d’une fonction ou d’un type cellulaire. Les avancées récentes des immunomarquages ont permis l’émergence du multiplexing. Les techniques classiques de marquage (colorimétrie ou fluorescence) ne permettent la détection que d’un nombre restreint de biomarqueurs sur une même coupe de tissu ne permettant pas d’appréhender la complexité du microenvironnement tissulaire. Les avancées récentes des méthodes en immunomarquage ont permis l’émergence du multiplexing tissulaire : détecter sur une même coupe de tissu plusieurs dizaines de biomarqueurs protéiques.
L’essor de ces technologies est associé à l’évolution d’une part, des possibilités de révélation des immunomarqueurs, des systèmes d’acquisition d’images plus performants en termes de sensibilité de détection et de résolution, et d’autre part au développement des approches d’analyses bio-informatiques et de l’intelligence artificielle. Les techniques de protéomique spatiale varient par leur stratégie de révélation (par une enzyme, par un anticorps couplé à un tag métallique ou à un fluorochrome, etc.). Dans tous les cas, le multiplexing permet une analyse spatiale du tissu. Quelle qu’en soit la méthode de révélation, il permet de comprendre l’organisation des populations cellulaires au niveau du tissu, par exemple pour l’étude du microenvironnement tumoral ou inflammatoire. En permettant une analyse spatiale du tissu, différentes méthodes de multiplexing en immunofluorescence existent et les questions scientifiques posées orientent le choix technologique.
Cet article présente quelques unes de ces méthodes : principe, étapes et points d’attention associés, acquisition et analyse des images, sur différents projets et types de tissus :
1) La méthode multiplex avec le système d’amplification du signal à la tyramide (TSA) couplé à des fluorochromes Opal™, développée par la société Akoya Biosciences®. Cette méthode permet la révélation simultanée jusqu’à 9 marqueurs.
2) La méthode multiplex grâce au système VectaPlex™ commercialisé par la société VectorLaboratories®. Cette méthode peut également être combinée à la précédente.
3) La méthode PhenocyclerTM (anciennement Codex® pour Co-Detection by IndeXing) distribuée par la société Akoya Biosciences®. Cette méthode permet la révélation de plusieurs dizaines de marqueurs.

La croissance du muscle squelettique chez les poissons de grande taille comme la truite procède à la fois par un mécanisme d’hypertrophie (augmentation de la taille) et d’hyperplasie (augmentation du nombre) des fibres musculaires pendant une grande partie de leur cycle de vie. La caractérisation et la quantification de ces évolutions structurales nécessitent de réaliser des coupes de muscle afin d’identifier les fibres musculaires et de mesurer leurs surfaces et diamètres en coupes transversales. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’outils permettant de faire ces analyses sur un grand nombre de fibres (800 à 1000) et sur de nombreux animaux. L’automatisation informatisée de ces mesures repose sur l’obtention d’images histologiques qui présentent un contraste suffisant entre les différents composants présents au sein du muscle (tissu conjonctif, adipeux et fibres musculaires). Ainsi, à partir d’échantillons inclus en paraffine, nous avons mis en œuvre des colorations histologiques comme celle du Rouge Sirius seul ou associé au Vert « Rapide » ou des marqueurs fluorescents comme l’agglutinine de germe de blé associée à des Alexa fluor™. Ces deux types de marquage permettent notamment de mettre en évidence le contour des fibres musculaires en vue de mesurer leur surface en coupe transversale. Ces analyses ont été utilisées dans différents programmes de recherche et nous ont permis de montrer les effets de facteurs d’élevage comme l’activité de nage ou l’origine génétique des animaux sur la croissance musculaire. Nous avons également pu montrer les relations entre la taille ou le nombre des f ibres musculaires et des paramètres de qualité comme le rendement en filet ou la résistance mécanique de la chair. Ces dernières années, l’utilisation des méthodes d’intelligence artificielle ont facilité l’analyse en permettant une détection automatique plus précise des fibres musculaires.

Le sevrage précoce des porcelets peut générer des problèmes de santé, principalement d’ordre digestif, du mal-être animal, un ralentissement de la croissance et parfois de la mortalité si les problèmes de santé ne sont pas traités à temps. Au sein de l’UMR INRAE PEGASE, nous travaillons sur des solutions nutritionnelles permettant de préserver la physiologie digestive et la santé des porcelets au moment du sevrage. Ces solutions accompagnent la filière dans ses efforts de démédicalisation du sevrage et de forte réduction de l’utilisation des antibiotiques dont l’usage et la prescription sont très réglementés. Parmi les solutions nutritionnelles, celles ciblant le microbiote intestinal sont particulièrement pertinentes. Dans cette étude, nous avons travaillé avec un acide aminé encapsulé pour cibler son utilisation par le microbiote des parties distales de l’intestin. La lysine encapsulée a été choisie sur la base de pré-essais qui ont montré des effets favorables sur le microbiote intestinal.
Pour cette expérimentation, 48 porcelets ont été nourris au moment du sevrage (à l’âge de 4 semaines) soit avec un aliment habituel (témoin, n=24), soit avec ce même aliment contenant de la lysine encapsulée dans une paroi lipidique (AA, n=24). Dix jours après le sevrage, un sous-groupe de 12 porcelets (6 témoins, 6 AA) a été euthanasié pour prélever le contenu du tube digestif (TD) (des segments de l’iléon et du colon) ainsi que du tissu d’iléon et de colon pour des études de morphologie en histologie. Les autres porcelets ont eu un suivi avec des prélèvements de sang jusqu'à 28 jours après le sevrage.
Les prélèvements d’iléon et de colon ont été fixés dans du formol à 4 %, puis ont subi toutes les étapes d’inclusion en paraffine. Des coupes de 5 µm ont été faites au microtome et colorées en hématoxyline éosine pour mesurer les villosités et les cryptes. Des images en mosaïque de l’iléon et du colon ont été faites à l’aide d’un microscope Zeiss Axio Imager M2 (ApoTome). Une identification des différentes structures de l’iléon et du colon a été effectuée et les zones d’intérêt ont été repérées.
Des mesures d’aire, de hauteurs de villosités et de profondeurs de cryptes ont été effectuées avec Image J. La supplémentation en lysine encapsulée du régime a augmenté la profondeur des cryptes de 14 % (P=0,09) sans que les autres paramètres ne soient modifiés. Notre hypothèse était que la lysine entraînerait une prolifération bactérienne et une augmentation de la production de métabolites favorisant la prolifération cellulaire à l’intérieur des cryptes. Ceci n’a pas été conforté par les analyses effectuées sur le microbiote et d’autres pistes sont donc à envisager.

L'histologie est essentielle pour comprendre les odeurs et le sens de l'odorat. Depuis la description du bulbe olfactif de lapin par Ramon y Cajal, de nombreux progrès ont été réalisés. En examinant les structures microscopiques et les interactions chimiques, l'histologie a contribué à percer les mystères des molécules odorantes et de leur perception, tant en conditions normales que pathologiques, comme lors des infections au SARS-CoV-2 associées à des troubles olfactifs. Cette discipline continue d'apporter des éclairages précieux en étudiant le système olfactif au cours du développement, dans différentes espèces, y compris celles disparues depuis longtemps. Cet éditorial explore les notions de parfum, fragrance, odeur et olfaction, en revisitant les aspects anatomiques, cellulaires et fonctionnels de ce sens fascinant et encore mystérieux

Le plastique est devenu progressivement une matière omniprésente dans notre environnement, professionnel ou personnel. Les laboratoires de recherche sont de grands consommateurs de plastiques. Cette matière est cependant un désastre environnemental. Conçue pour être inerte (non réactive chimiquement avec son environnement) et très solide, la matière plastique se dégrade très peu et très mal dans la nature. Ainsi plus de 350 millions de tonnes de déchets plastiques sont générées chaque année à l’échelle de la planète. Si rien n’est fait, cette quantité devrait tripler d’ici à 2060. Ce plastique perturbe l’environnement comme les êtres vivants par ses déchets, qu’ils soient encore à l’état visible ou non, puisqu’ils se « dégradent » en micro et nanoparticules, mis en évidence dans tous les milieux y compris dans les organismes vivants. Et sa production principalement d’origine pétrolière génère un impact environnemental très dommageable (gaz à effets de serre, pollution, etc.).
Il est crucial d’agir de toute urgence et à différentes échelles, industrielle, politique, mais aussi individuelle et collective afin de réduire cette quantité catastrophique de déchets permanents et de réduire notre dépendance à cette matière. Dans le présent article, après quelques rappels historiques et contextuels de la problématique visant à éclairer le lecteur sur le pourquoi il est urgent de réduire l’utilisation du plastique dans notre quotidien, - y compris dans les laboratoires, nous donnerons des premiers éléments d’actions pratiques possibles. Nous partageons ainsi des pistes sur le comment modifier les pratiques au laboratoire afin de se diriger vers une démarche plus vertueuse d’utilisation du plastique.